La llamada dinastía Justiniana empezó en el año 518 luego del ascenso al trono de Justino, comandante de la guardia palatina de Anastasio, el último emperador de la dinastía Teodosiana. Anastasio murió de avanzada edad y sin dejar hijos varones, por lo que Justino, hombre de confianza del imperio, fue elegido para sucederle. Consciente de que no tenía las dotes de gobierno necesarias para ejercer un mandato fuerte, así como del hecho de que no lograría engendrar un hijo que continuara su dinastía, pues era ya un hombre sexagenario cuando llegó al poder, Justino buscó rodearse de asesores capaces e inteligentes, entre ellos su sobrino Flavius Petrus, al que terminó por adoptar como hijo y quien finalmente ascendió al trono en 527, luego de la muerte de Justino, con el nombre de Justiniano.
El reinado del emperador Justiniano, entre los años 527 a 565, ha sido considerado como uno de los momentos cumbres del imperio romano de Oriente, cuando se restauraron gran parte de los territorios que habían estado bajo dominación romana hasta los tiempos del reinado unificado de Teodosio y la corte bizantina vivió un gran esplendor a nivel económico, político, religioso y social. Sin embargo, durante la década del 540 el imperio se vio azotado por un brote de peste (posiblemente peste negra o bubónica) que afectó seriamente a gran parte de la población. Aunado a esto, los grandes gastos en que incurrió el gobierno para el mantenimiento de las guerras y las construcciones monumentales dejaron exhausto el tesoro imperial, con lo que se inició a partir de entonces un proceso de declive que tardaría mucho tiempo en ser revertido.
Al emperador Justiniano le sucedió en el año 565 su sobrino, Justino II, que no mostró mucha habilidad para capitalizar los grandes logros alcanzados por su predecesor y debió hacer frente a numerosos descalabros en la defensa de los territorios del imperio. Pocos años después de la muerte de Justiniano los lombardos empezaron a penetrar en Italia, conquistando el norte de la península y asentándose luego en ella, en un proceso continuo que habría de mantenerse por los siguientes tres siglos. Por otra parte, se reiniciaron en el este los conflictos con el imperio persa de los Sasánidas, que desestabilizaron esta frontera y terminaron con un desfavorable tratado de paz y el pago de unas exorbitantes reparaciones de guerra a los persas. Los últimos años del reinado de Justino estuvieron marcados por su inestabilidad mental, que paulatinamente lo fue inhabilitando para el ejercicio del mando, así como por el reinicio de las persecuciones religiosas, esta vez contra el monofisismo, una doctrina herética cristiana que gozaba de gran difusión en la parte oriental del imperio, y por un nuevo rebrote de peste.
Para sucederle en el año 578 fue elegido Flavio Tiberio, militar y hombre de confianza del emperador, quien había jugado un importante papel para asegurar su entronización, y que ya había sido nombrado regente cuatro años antes, ante el deterioro mental de Justino. Flavio Tiberio ascendió al poder como Tiberio II, pero solo pudo reinar durante cuatro años, tiempo en el que no logró resolver ninguno de los conflictos exteriores que amenazaban al imperio; por el contrario, debió lidiar con el creciente problema de las incursiones bárbaras dentro de su territorio, y terminó por incorporar un cuerpo de quince mil soldados extranjeros dentro de su ejército que con el tiempo dio origen a la llamada Guardia Varega, la guardia personal del emperador. Antes de morir, en 582, casó al general Mauricio con una de sus hijas, Constantina, a fin de asegurar la sucesión.
Mauricio se mantuvo en el poder durante veinte años, y mostró ser un gobernante capaz y equilibrado, pese a lo cual no logró frenar satisfactoriamente el proceso de desintegración que iba menguando poco a poco el gran imperio dejado por Justiniano. A partir de 588, y ante una situación de guerra civil dentro del imperio persa, Mauricio tomó parte activa en la recuperación del trono de los Sasánidas por parte del Shah Cosroes II, gracias a lo cual pudo estabilizar de nuevo la frontera oriental y firmar un tratado de paz con los persas que se mantuvo vigente durante todo su reinado.
En Italia, y a fin de cuidar los intereses del imperio dentro de la península, Mauricio creó el Exarcado de Rávena, un mandato semi autónomo que mantenía a esta ciudad y a Roma bajo la autoridad bizantina, frente al domino creciente de los bárbaros lombardos. Sin embargo, esto generó roces con el papado, que empezó a distanciarse cada vez más de la autoridad imperial. También, para ejercer el control sobre las islas y los territorios africanos e hispanos en el Mediterráneo occidental se creó el Exarcado de Cartago, que gozaría de gran poder y jugaría un papel determinante en los acontecimientos posteriores del siglo siguiente.
Las guerras azotaron constantemente el reinado de Mauricio, con el consecuente declive de las finanzas imperiales y el aumento de la presión fiscal sobre diversas capas de la población. A finales de siglo, un gran contingente de soldados fue hecho prisionero por los ávaros en la frontera norte del imperio, los cuales exigieron un cuantioso rescate para realizar la devolución de los hombres. Mauricio, incapacitado de realizar el pago, se negó a acceder al rescate y todos sus hombres fueron asesinados, lo cual generó un gran malestar entre los militares. Cuando, un par de años después, se les pidió a los soldados del ejército del Danubio que pasaran el invierno al otro lado de la frontera, en malas condiciones de aprovisionamiento y peligrosamente expuestos, los hombres se amotinaron y encabezaron una rebelión que llegó hasta la misma capital, bajo el mando de Focas, uno de sus generales. Mauricio huyó entonces con toda su familia al Asia Menor, mientras Focas se erigía en Constantinopla como nuevo emperador. Poco después, el antiguo emperador Mauricio era tomado prisionero y asesinado junto a todos sus hijos varones, con lo cual moría así de manera trágica la dinastía Justiniana.
